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表皮生长因子受体(EGFR)调控尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU)促进食管癌浸润转移的机制研究
刘涛;王家路;罗淑娟;冯潇文;李慧芳;卢晓梅;目的 探讨表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)调控尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator, PLAU)在食管癌中的功能机制。方法 取食管癌和食管癌癌旁组织芯片，在组织水平上，采用酪酰胺信号放大技术检测食管癌及癌旁组织的EGFR的表达水平，分析食管癌组织EGFR的表达与临床病理参数的相关性，应用Kaplan-Meier生存曲线分析EGFR表达与食管癌患者预后的相关性。在细胞水平上转染shEGFR质粒，敲减EGFR基因表达，分为Control组、shEGFR-1和shEGFR-2组，分别应用噻唑蓝(MTT)、细胞划痕、Transwell试验分析其对食管癌细胞增殖、转移和侵袭能力的影响。4D非标记定量蛋白质组学法检测表皮生长因子(EGF)组和Control组细胞，筛选差异表达蛋白。采用免疫组织化学法检测食管癌和食管癌癌旁组织中PLAU蛋白的表达，分析食管癌组织中PLAU的表达与临床病理参数的相关性。应用STRING平台构建差异蛋白互作网络，分析EGFR与PLAU的互作关系。采用蛋白免疫印迹法检测shEGFR-1组细胞PLAU的表达。结果 在组织水平上，EGFR在食管癌组织中高表达，其表达水平与食管癌的N分期相关，且EGFR表达量越高，其预后越差；在细胞水平上，转染shEGFR敲减EGFR基因后，食管癌KYSE150细胞的增殖明显受到抑制；与Control组相比，shEGFR-1(37.27±3.12)和shEGFR-2组(38.43±6.32)划痕愈合率降低；shEGFR-1组(351.00±3.00)和shEGFR-2组(548.00±4.00)侵袭到下室的细胞数量减少(P<0.001);蛋白组学结果显示，EGF明显上调PLAU蛋白的表达，蛋白互作网络提示EGF与PLAU存在直接互作关系。在细胞水平上敲减EGFR后，PLAU蛋白表达下降。PLAU在食管癌组织中高表达，并与肿瘤直径和病理分级呈正相关。结论 EGFR基因在食管癌中扮演癌基因角色，并且与PLAU具有正向协同作用，EGFR可能通过调控PLAU促进食管癌的进展。
PKM2特异性突变协同免疫检查点重塑食管鳞状细胞癌微环境并促进肿瘤进展
罗淑娟;王巧卷;阿依迪达尔·努尔巴哈提;蔡邦武;郑树涛;卢晓梅;目的 探讨丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2,PKM2)的K367M、R399E不同突变位点对免疫检查点程序性死亡配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)、程序性死亡配体2(Programmed death-ligand 2,PD-L2)及炎症因子白细胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达的调控作用，分析其在食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)免疫逃逸及肿瘤免疫微环境重塑中的潜在机制。方法 构建KYSE150细胞稳定表达PKM2野生型(PKM2-WT)、PKM2-K367M和PKM2-R399E突变体，以及AKR细胞稳定敲低PKM2(shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2)的细胞模型。采用定量磷蛋白组学技术分析PKM2-WT与PKM2-K367M和PKM2-R399E之间的差异磷酸化蛋白。通过流式细胞术验证PKM2-K367M和PKM2-R399E突变体在KYSE150细胞中的表达稳定性，并检测PD-L1、PD-L2、IL-1α和IL-1β的表达水平。采用蛋白免疫印迹法检测表达PKM2-K367M或PKM2-R399E突变体的KYSE150细胞以及shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2的AKR细胞中PKM2、PD-L1、PD-L2和IL-1α的蛋白表达。将AKR对照细胞及shRNA-PKM2-1敲低细胞皮下接种C57BL/6N小鼠，每组3只，建立移植瘤模型，测量肿瘤体积和重量，通过免疫组化检测肿瘤组织中PKM2、Ki-67、PD-L1和PD-L2的表达。结果 构建稳定表达PKM2野生型(PKM2-WT)、PKM2-K367M及PKM2-R399E突变体的人食管鳞癌KYSE150细胞株，以及稳定敲低PKM2的鼠源AKR细胞株。与PKM2-WT组相比，PKM2-R399E组IL-1α上调，PKM2-K367M和PKM2-R399E组普列克底物蛋白和Sec7结构域蛋白3(PSD3)上调，PD-L1、PD-L2、IL-1α和IL-1β的表达均升高(P<0.05)。与Control组比较，shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2组AKR细胞中PKM2、PD-L1、PD-L2、IL-1α的蛋白表达均降低(P<0.05)。体内实验中，与Control组比较，shRNA-PKM2-1组肿瘤重量降低，细胞质中PD-L1、PD-L2及细胞核中Ki-67的表达均降低(P<0.05)。结论 PKM2不同突变位点可通过差异性调控PD-L1、PD-L2及IL-1α、IL-1β的表达，并伴有PSD3上调，提示PKM2通过免疫-代谢机制参与ESCC免疫检查点调控及肿瘤免疫微环境重塑。
BTF3在食管鳞癌中的转录调控网络构建及关键靶基因的功能验证
刘清;冯潇文;陈娇;彭天元;李天琪;卢晓梅;目的 探讨基本转录因子3(Basic transcription factor3,BTF3)在食管鳞癌细胞中的下游转录调控网络及其关键靶基因。方法 在食管鳞癌KYSE150细胞中，利用染色质免疫共沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)鉴定BTF3的全基因组结合位点；结合慢病毒转染稳定敲低BTF3后的KYSE150细胞RNA测序(RNA sequencing, RNA-seq)所得差异表达基因，筛选BTF3的直接调控靶点；通过染色质免疫共沉淀-聚合酶链式反应(Chromatin immunoprecipitation-quantitative polymerase chain reaction, ChIP-qPCR)对关键候选靶基因进行验证。结果 ChIP-seq分析揭示了BTF3在基因组上的特异性结合图谱。相较于对照组(Input组),免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)组以C/G富集、特别是包含CCCC或CCC核心的序列作为最显著的基序(Motif),BTF3在基因组中的结合高度富集于基因间区和内含子区域，基因本体论(Gene ontology, GO)-细胞组分(Cellular component, CC)显示靶基因显著富集于胞外区域、细胞外空间和含胶原蛋白的细胞外基质，生物过程(Biological process, GO-BP)显示靶基因主要富集在G蛋白偶联受体信号通路和信号转导生物学过程，分子功能(Molecular function, GO-MF)显示靶基因主要参与G蛋白偶联受体活性、蛋白质结合以及RNA结合。对BTF3敲低的RNA-seq数据中得到的441个差异表达基因与ChIP-seq实验中出现的富集峰(peak)所在的基因进行整合分析，共鉴定出54个重叠基因，即BTF3潜在的直接调控靶基因。这54个重叠基因在胞外区域和细胞外空间有显著富集(GO-CC),重叠基因主要参与正向调节基因表达的生物学过程(GO-BP)以及蛋白质结合(GO-MF)。ChIP-qPCR实验证实BTF3是关键靶基因2′-5′-寡腺苷酸合成酶样蛋白(OASL)、纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)、CEBPB反义RNA 1(CEBPB-AS1)和组蛋白H2B簇成员11(H2BC11)的直接转录调控因子。结论 食管癌中BTF3是一个广泛结合在基因组非启动子区域的转录因子，可能通过增强子或内含子调控元件发挥转录调控功能，直接结合并转录调控包括OASL、FGL2、CEBPB-AS1和H2BC11在内的一组下游靶基因，在细胞信号转导和微环境调控中可能扮演重要角色。
MRPL家族在肿瘤生物学中的作用与机制研究进展
卢晓梅;阿依迪达尔·努尔巴哈提;线粒体是细胞的能量代谢枢纽，其功能障碍会导致能量供应不足、活性氧失衡及细胞损伤，进而促发多种病理状态。线粒体核糖体由大小亚基构成，负责翻译线粒体基因组所编码的13种呼吸链关键亚基。近年来，线粒体核糖体大亚基蛋白(Mitochondrial ribosomal protein large subunit, MRPL)在肿瘤生物学中的研究迅速升温。大量证据表明，MRPL成员通过调控线粒体蛋白合成、代谢重编程、活性氧平衡以及核基因表达网络，直接影响癌细胞的增殖、凋亡、侵袭等关键表型。本文系统综述了MRPL家族的结构特征、功能及在肿瘤发生发展中的多重功能，阐明其对肿瘤进展的作用机制。通过整合最新的组学、功能试验及临床关联数据，旨在为MRPL家族在癌症中的角色提供全面的认识。
细粒棘球蚴外泌体来源egr-miR-71-5p对肝星状细胞的调控作用及机制研究
孙钰钦;周璇;田凤鸣;马玉玉;孟·孟根;周金萍;陈佳慧;王浩楠;马佳雪;马秀敏;目的 探究细粒棘球蚴外泌体来源的egr-miR-71-5p对人肝星状细胞系(LX2)活化的调控作用及转化生长因子-β(TGF-β)/SMAD信号通路机制，为细粒棘球蚴病防治提供潜在靶点。方法 对课题组前期测序数据进行生物信息学分析，筛选出高表达的egr-miR-71-5p;采用差速离心法分离细粒棘球蚴外泌体，通过透射电镜、粒径检测、蛋白免疫印迹(选用CD63、TSG101标志物)完成鉴定；通过PKH67荧光示踪实验证实LX2细胞对该外泌体的内吞能力，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证egr-miR-71-5p在外泌体和LX2细胞的表达情况；设计合成egr-miR-71-5p的模拟物(mimic)、抑制剂(inhibitor)及对应阴性对照和阴性荧光对照并转染LX2细胞，镜下观察荧光强度判断转染效率，RT-qPCR验证egr-miR-71-5p转染效率；细胞分组后，采用RT-qPCR、蛋白免疫印迹检测纤维化相关标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、视黄酰基转移酶(Lecithin retinol acyltransferase, LRAT)和TGF-β/SMAD通路分子TGF-β、磷酸化SMAD2/3(Phosphorylated SMAD2/3,p-SMAD2/3)、SMAD4的基因与蛋白表达水平。结果 生物信息学分析显示egr-miR-71-5p在细粒棘球蚴外泌体中高丰度表达，RT-qPCR验证结果一致；成功分离鉴定细粒棘球蚴外泌体，PKH67荧光示踪实验证实LX2细胞可高效内吞该外泌体且胞内检测到egr-miR-71-5p表达；转染后，模拟物组egr-miR-71-5p表达量较阴性对照组升高约16 777倍(P<0.000 1),α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β、p-SMAD2/3、SMAD4的基因与蛋白表达水平降低(P<0.000 1),LRAT表达升高(P<0.000 1);外泌体+抑制剂组上述指标呈相反表达趋势(P<0.000 1)。结论 细粒棘球蚴外泌体来源的egr-miR-71-5p通过抑制TGF-β/SMAD信号通路，进而抑制LX2细胞活化进程，该miRNA有望成为细粒棘球蚴病相关肝纤维化的潜在诊断标志物及潜在靶点。
